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    維生素檢測國標法本底污染的原因分析

    發布時間: 2023-07-17

    引言

    近年來,檢測行業中維生素項目的檢驗日益增多。大家在面對維生素復雜的操作過程時遇到了各種各樣的問題,包括樣品稱樣量的計算、標準曲線擬合方式的選擇、樣品稀釋倍數的選擇、標準菌的活化等等。其中最讓大家頭疼的一個情況是標準曲線整體渾濁。造成標曲整體渾濁的原因是多種多樣的,但是今年我們又發現了一個更隱秘的影響因素,現分享給大家,希望大家能避免標曲整體渾濁,保證實驗順利進行。



    想戰勝你的敵人,就要了解你的敵人。維生素的難點到底在哪兒呢?其實維生素項目的難點很多,還很細。追究其核心,主要是因為維生素的含量很低,低到非常容易受到其他因素的干擾。而且這些干擾因素,看不見,摸不著,一個不留神,我們就被偷襲了。結果就是這樣:


    維生素檢測國標法本底污染的原因分析


    看到此圖時,大部分實驗員估計已經心生絕望,幾天的辛苦又將付諸東流。所以大部人的反應都是趕緊拿遠點,我再也不想多看它一眼。

    但是,這是不對的呦!


    我們應該積極面對問題,盯著這個標曲,然后思考。它為啥這么渾濁呢?為啥沒有梯度呢?為啥標曲設定的時候要有接種空白和不接種空白呢?好了,你接近真相了!









    首先我們要明白標曲設定接種空白和不接種空白的目的。普通的微生物試驗,我們面臨的只有一個威脅,叫微生物污染,也叫雜菌污染。但是維生素試驗面臨的是兩個威脅,一個是微生物污染,還有一個是維生素污染,也叫本底污染。所以不接種空白用來監測的主要是傳統的微生物污染。不接種空白在滅菌后是沒有操作的,試管不需要打開,一直保持著滅菌的密閉環境。如果不接種空白渾濁了,重點排查滅菌是否徹底,培養環境是否污染。

    接種空白用來監測的主要是維生素污染,以及維生素檢測特有的微生物污染。所以當不接種空白澄清、接種空白渾濁時,就有兩個可能性:一是菌不純,對維生素沒有單一特定關系,所以不成梯度。二是試驗中混入了除標品以外的維生素,促進測定菌株生長,使菌株對樣品中待測維生素或標液中維生素失去了特異性,造成標曲中各試管標品濃度不成梯度,從而表現為標曲試管整體渾濁不成梯度。那么到底是菌的問題還是維生素的問題呢?







    為了確定方向,也許我們要做很多排查工作:

    ?比如將菌純化,驗證;
    ?比如把所有器皿重新洗刷、酸泡、高溫烘烤;
    ●?比如將標準溶液重新配制;
    ●?比如驗證槍頭、濾膜等等一次性耗材是否有維生素污染;
    ●?比如找其他人員協助對比;
    ●?比如...







    但是,其實,捷徑就在眼前。我們為什么不去測測那套渾濁的標準試驗管呢?哪怕我們需要壓抑住自己內心抗拒的波瀾。


    一、如果我們測出來結果是這樣的(編撰數據):

    維生素檢測國標法本底污染的原因分析


    其中S1是不接種空白,S2是接種空白??梢悦黠@的看出:標曲各點的吸光度值幾乎一致,凡是接菌的均明顯生長,且沒有任何梯度。那么結論也非常明顯,就是測定菌株對待測維生素沒有特異性關系,有兩種可能:一是菌受到了雜菌污染,在試管內生長的以雜菌為主;二是體系中引入不明來源的維生素。


    二、如果我們測出來結果是這樣的(編撰數據):

    維生素檢測國標法本底污染的原因分析


    那要恭喜兄臺了!雖然梯度很小,但是是有的,只是你的雙眼被蒙蔽了。只有借助紫外分光光度計才能發現梯度。當你感激涕零,準備計算結果時,我只好冷酷的告訴你,這個標曲不能用。

    因為四項維生素國標里泛酸明確規定了接種空白吸光度值不能超過0.2,而葉酸2014版曾經規定了接種空白吸光度值不能超過0.1。







    GB 5009.210-2016?《食品中泛酸的測定》6.7條款“如果0對照管有明顯的細菌增長,或者與0對照管相比,標準0管透光率在90%以下(或吸光度值在0.2以上;或標準系列管透光率最大變化量<40%(或吸光度值變化量<0.4),說明可能有雜菌或不明來源的泛酸混入,需重做試驗


    2022版葉酸、維生素B12和2016版生物素,只對不接種空白有要求,而對接種空白沒有明確要求。對沒有明確要求的部分,大家一般會參考同系列標準中對此有要求的標準,所以嚴格的話,還是會參考泛酸標準。畢竟從原理上講,接種空白是不應該生長的,現在長到0.653,畢竟不是最完美狀態,對結果的影響完全未知。所以最穩妥的辦法是找出維生素污染源然后把它清除掉。







    那么可能的污染源是啥呢?前文提到了:所有玻璃器皿的潔凈度;槍頭或移液器的潔凈度;環境的潔凈度;標品配制的準確性及稀釋過程的準確性等等。不過,最近小編還發現了一個更隱秘的維生素污染源----接種液。


    我們維生素試驗用到的接種液在接種前都是經過特別處理后,去除菌液中殘存維生素的。比如葉酸通過“饑餓”培養6小時來清除菌液中殘存葉酸。泛酸、生物素和維生素B12都是通過“離心-洗脫”三次來去除接種液中殘存維生素。但是,當我們操作不當時會造成接種液中殘存維生素含量遠遠超過方法的去除能力,導致接種液中帶入維生素,從而污染體系,導致維生素本底污染,干擾維生素測定。


    比如:葉酸菌株活化時我們沒有使用標準要求的4mL葉酸測定培養基加2mL葉酸標準工作液,而選用了乳酸桿菌肉湯或MRS肉湯進行活化。那結局是很慘痛的,小編自己也深有體會。


    再比如:生物素和維生素B12菌株活化時使用的乳酸桿菌肉湯培養基中的番茄汁配制不合規,那也會引起維生素本底的污染。最近小編就碰到了好幾個案例,由于維生素標準中未明確番茄汁的配制方法,所以不少實驗員就用了最直接的思路:番茄整個榨汁。這種番茄汁配制后濃度太高,維生素殘留量太大,超過了離心洗脫能處理的范圍,所以配制后的情況就如下圖所示。

    維生素檢測國標法本底污染的原因分析


    用直接壓榨的番茄汁配制的培養基活菌,離心后菌體是發紅的??赡懿煌瑢嶒炇遗渲品阎瓭舛葧兴煌?,紅色會有深淺,相當于番茄的殘留也會有所不同。但是只要有明顯紅色,就說明有不少番茄的殘留被加入了實驗管中,那么維生素的殘留就不可避免,以小編經驗,接種空白吸光度值輕松達到0.2以上。而正常合規的番茄汁配制的培養基活菌離心后,菌體本身都是白色的,幾乎見不到紅色,維生素污染就會控制在要求范圍內。







    那么合規的番茄汁應該如何配制呢?翻遍食品微生物和維生素相關標準,只有雙歧桿菌檢驗的國標中有描述:


    GB 4789.34-2016?《雙歧桿菌檢驗》A.1.2.2條款:“西紅柿浸出液的制備:將新鮮的西紅柿洗凈后稱重切碎,加等量的蒸餾水在100℃水浴中加熱,攪拌90min,然后用紗布過濾,校正pH 7.0±0.1,將浸出液分裝后,121℃高壓滅菌15min-20min?!?/span>


    所以各實驗室可以參考此標準配制。不過配制過程還是很繁瑣的,單一個煮沸就需要90min,所以也可以直接使用陸橋公司的即用型無菌番茄汁(貨號:CMT135;規格:100mL/瓶)。隨用隨加,無需準備,從此遠離維生素本底污染的困擾,你值得擁有哦!

    維生素檢測國標法本底污染的原因分析





    看到這里是不是覺得維生素檢測簡直是“步步驚心”,好好的接種液居然也會暗藏兇險。沒辦法,本質上還是因為檢測過程中的維生素含量太低了,非常容易受到各種因素的影響,所以需要我們提高熟練度,吸取別人的經驗教訓,早日攻克維生素實驗的各處難關。陸橋也提供即用型試管和微孔板法的各項目維生素檢測試劑盒,幫您少走彎路,避坑繞錯,早日實現“維生素檢測自由”!



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